钉螺对氯硝柳胺敏感性的研究

【摘要】血吸虫病是一种严重危害社会经济发展和人民身体健康的人畜共患寄生虫病，该疾病流行于76个国家和地区，目前全球约有血吸虫病病人2亿。我国主要流行日本血吸虫病，全国现有病人约32.58万，有螺面积37.4亿m2，现阶段该疾病仍是我国重要的公共卫生问题。从血吸虫病防治初期开始至今，查灭螺一直是我国血防工作的重点，80年代前，我国主要采取灭螺为主的综合防治策略，至1992年世界银行贷款中国血吸虫病控制项目，氯硝柳胺作为WHO唯一推荐使用的杀螺药在我国血吸虫病流行疫区得到了大面积的推广应用，也正是氯硝柳胺的使用大大推动了我国血吸虫病防治工作的进程。但是文献报道，不同现场环境、气候条件会影响氯硝柳胺的杀螺效果，由此可见，在全国范围疫区内及各种不同环境条件采用统一的杀螺剂量会出现杀螺效果不一致的现象，一方面有些疫区无法达到预期的杀螺效果，导致钉螺孳生或扩散，不利于疫情的预防与控制；反之，则有些疫区施用过量药物，造成资源浪费以及加重环境负荷。那么导致上述杀螺效果不一致的原因是不同地区钉螺本身对氯硝柳胺的敏感性不一致，亦或是钉螺对氯硝柳胺的敏感性受到现场环境或气候因素的影响所致，国内外均未见相关报道。本研究通过定量评价钉螺对氯硝柳胺的敏感性受环境温度以及钉螺与药物可接触时间的影响，并以此为前提，在实验室测定不同季节与不同地区钉螺对氯硝柳胺的敏感性，从而建立中国大陆钉螺对氯硝柳胺敏感性的基础数据库，旨在为不同现场的杀螺工作选择正确合理的药物剂量提供理论支持，并可以在此基础上进一步制定符合现场实际的标准化杀螺规范技术，在发挥杀螺药最佳杀螺效果的同时减少杀螺药的浪费，大量节约血吸虫病控制成本的同时进一步优化资源的配置，大力推进血吸虫病防治工作的进程与发展；另一方面可以最大限度地减少环境污染，降低环境负荷，以保证杀螺举措的长效、可持续发展。众所周知，杀螺效果是杀螺药物筛选与考核的关键要素，然而无论是现场杀螺效果还是实验室药效评价均离不开标准化的药效评价实验方法，需要遵照国际公认的实验操作规范和标准操作程序，无论是药物的来源、实验钉螺还是实验条件的控制均需要进行标准化与规范化，这样才能保证实验结果的可靠性、准确性以及实验结果间的可比性。近年来本实验室对氯硝柳胺等相关杀螺药的室内筛选以及药效评价方法进行了标准化研究，发现室内浸杀法实验所用钉螺数以10只/组为佳，省工省时，差错率低，杀螺效果可靠，而且重复性好；并且每只钉螺的杀螺药液体积宜大于3.3ml；此外，从野外带回实验室的钉螺在室内饲养时间不能超过11d，否则钉螺对杀螺药的敏感性显著降低，可影响杀螺效果的评价。上述研究结果为国内杀螺药药效评价以及新药筛选实验方法标准化的建立提供了可行性的标准，但是，钉螺每年仅繁殖一代，生命周期相对较长，区别于光滑双脐螺和蚊子等媒介可以连续繁殖传代，实验室内多能提供标准的传代株供生物测定研究，目前实验室尚无室内传代的标准株钉螺供相关实验所用，而是从现场采集，每年不同时间进行实验的钉螺均是从现场即采即用，不同实验室所用钉螺来源于不同地区或不同季节，那么不同地区或不同季节的钉螺对氯硝柳胺的敏感性是否存在差异，这种差异是否对杀螺药筛选以及药效评价结果产生影响？不得而知。本研究通过定量评价钉螺对氯硝柳胺的敏感性受温度以及钉螺与药物可接触时间两因素的影响，并在此基础上测定不同地区与季节钉螺对氯硝柳胺的敏感性是否存在差异，探讨采集于不同地区与不同季节的钉螺用于药效评价与新药筛选是否会对实验结果产生影响，从而进一步完善上述药效评价与新药筛选实验方法的标准化。一钉螺对氯硝柳胺敏感性受温度与时间的影响本研究从江苏省镇江市江滩采集钉螺，带回实验室用草纸盘饲养1-2d后，采用药物浓度分别为1g/L、0.1g/L、0.01g/L与1mg/L的50%氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂（WPN）在不同温度下对其进行浸杀实验，并通过CLL模型分析WPN在不同温度浸杀钉螺不同时间的生物测定数据，以评价不同温度以及钉螺与药物接触不同时间下WPN的杀螺效果，从而定量分析钉螺对氯硝柳胺的敏感性受温度以及钉螺与药物可接触时间影响的水平和程度。结果显示，温度与时间效应参数均达到显著水平，说明温度效应与时间效应均显著；所建模型通过Hosme-Lemeshow拟合异质性检验，对各处理所建模型均不存在异质性，即该模型能够较好地拟合WPN浸杀钉螺效果的生物测定数据，从而反映钉螺对药物的敏感性随温度以及钉螺与药物可接触时间的变化趋势。不同浓度WPN浸杀钉螺效果经CLL模型拟合，温度效应β值分别为2.5264、2.3609、1.6953和4.5557，该值反映了钉螺对各浓度WPN敏感性随温度变化的敏感程度。钉螺对各浓度WPN敏感性的时间效应参数最大值分别为：WPN1g/L浸杀20min、WPN0.1g/L浸杀2h、WPN0.01g/L浸杀20h与WPN1mg/L浸杀48h，分别反映了各浓度WPN浸杀钉螺的理论快速死亡期。根据CLL模型估计WPN浸杀钉螺不同时间的致死温度，1g/L的WPN浸杀钉螺1、3、5、10与20min致使钉螺99%死亡所需温度分别48.42、26.80、19.09、9.50与3.55℃；0.1g/L的WPN浸杀钉螺1、3、5、10、20、60与120min致使钉螺99%死亡所需温度分别142.99、68.33、45.77、40.43、35.36与1.81℃；0.01g/L的WPN浸杀钉螺低于4h时，致使99%钉螺死亡所需温度高于100℃，而浸杀8、12、16与20h时所需温度分别为81.96、58.76、27.61与1.20℃；1mg/L的WPN浸杀钉螺低于8h时，致使99%钉螺死亡所需温度高于100℃，而延长浸杀时间至72h时，仅需19.44℃。可见，时间因素对致死温度具有一定影响。一般，随时间的增加，一定浓度的WPN浸杀钉螺所需的温度逐渐降低，相应的致死温度也随之降低。同时，由CLL模型还估计出不同温度下WPN浸杀钉螺的致死时间，0℃时1g/L的WPN浸杀1h能使钉螺99%死亡，温度升至5℃时，钉螺99%死亡仅需20min，20℃时仅需5min，30℃时不到2min钉螺即可全部死亡；0.1g/L的WPN浸杀时，0℃时99%钉螺死亡需要3h，10℃时不到1h，钉螺即可全部死亡，温度升高至20℃以上时，仅需30min钉螺即可全部死亡；0.01g/L的WPN浸杀钉螺时，0℃下需要26h钉螺可达到99%死亡，升高至5℃时则需24h，30℃时则仅需14h钉螺即可99%死亡；而1mg/L的WPN浸杀时，低温情况下该浓度WPN杀螺效果较差，15℃时仍需6d才能致使99%的钉螺死亡，20、25与30℃时分别需要56、35与22h钉螺才能全部死亡。结果表明CLL模型适用于分析杀螺药杀螺效果的生物测定数据，同时也说明了温度与时间存在相互作用，钉螺对药物的敏感性同时受温度以及钉螺与药物可接触时间的影响，因此，无论是从有效杀灭钉螺，预防与控制血吸虫病的传播，减少资源浪费与环境污染，或延缓钉螺对其抗药性的产生出发，都非常有必要提倡合理使用氯硝柳胺，根据本研究中CLL模型拟合的不同温度与钉螺与药物接触不同时间下钉螺死亡概率，以及致死温度与致死时间互为函数的关系，氯硝柳胺合理化使用的可操作空间很大。现场灭螺在考虑当地螺情以及防治目标的实际需要基础上，还需根据现场环境、气温以及天气因素所控制的钉螺与药物可接触时间采用合理的施药剂量，达到最佳杀螺效果的同时，减少杀螺药的滥用及浪费，降低环境污染及减缓钉螺抗药性的产生；同时在现场灭螺工作中，可以参考灭螺现场当时的施药剂量、温度以及钉螺与药物实际接触时间，利用CLL模型拟合钉螺死亡概率，对现场灭螺效果进行预测和评价，以及时了解和掌握钉螺控制的进程。二不同季节钉螺对氯硝柳胺敏感性的测定本研究自2010年6月至2011年5月止，每月在江苏镇江江心洲江滩采集钉螺带回实验室，室内用草纸盘饲养1-2d后，选取活力较好的7-8旋成螺作为实验用钉螺待用，用脱氯自来水将WPN配制成药物浓度分别为1.000、0.500、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016与0.008mg/L的药液，在温度(25±1)℃、湿度60%、光照充足的生物培养箱内对上述钉螺进行室内浸杀实验。浸杀每月钉螺24h的LC50波动范围为0.143~0.209mg/L，服从正态分布，均值为0.166mg/L，95%可信区间为0.152~0.180mg/L。浸杀钉螺48h的LC50波动范围为0.108~0.170mg/L，服从正态分布，均值为0.140mg/L，95%可信区间为0.126~0.153mg/L。对不同浓度WPN浸杀不同月份钉螺死亡率进行Logistic多因素回归分析，浸杀24h与48h组不同月份钉螺死亡率均未见差异；将不同月份按照季节划分，不同季节间钉螺对WPN的敏感性也未见差异。结果说明控制温度、光照等因素，实验室条件下WPN对不同月份采集钉螺的杀灭效果较稳定，即不同季节钉螺对WPN的敏感性一致是其生物学特性，提示理论上不同季节灭螺采取统一的推荐剂量是可行的，但是实际灭螺工作中不同季节的现场环境、气候等因素并不一致，所以在实际的现场灭螺工作中还是应充分考虑现场温度以及钉螺与药物可接触时间，以此为基础对施药剂量进行适量调整，以达到最优杀螺效果。同时说明控制温度、湿度和光照一致的标准化浸杀条件下，全年采集各月当时钉螺进行浸杀实验，不会对实验室药效评价以及杀螺药筛选结果产生影响；采集于不同季节的钉螺用于实验也不会影响钉螺对杀螺药抗药性纵向监测的准确性。三不同地区钉螺对氯硝柳胺敏感性的测定本研究共抽取了我国10个血吸虫病流行省份，37个采样点采集钉螺，所采集钉螺带回实验室用草纸盘饲养1-2d后，选取活力较好的7-8旋成螺作为实验用钉螺待用，WPN用脱氯自来水分别配制成药物浓度为1.000、0.500、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016与0.008mg/L的药液，在温度(25±1)℃、湿度60%、光照充足的生物培养箱内对上述不同地区所采集钉螺进行室内浸杀实验。WPN浸杀37个采样点所采集钉螺24h的LC50均数为0.157mg/L，其95%可信区间为0.142-0.174mg/L；而WPN浸杀36个（除湖南石门）采样点所采集钉螺48h的LC50均数为0.114mg/L，其95%可信区间为0.102-0.126mg/L；各采样点钉螺对WPN的敏感性并未显示出地域性或地理性聚类现象；不同省份、不同类型流行区钉螺对WPN的敏感性差异无统计学意义；而将本次不同地区钉螺对WPN的敏感性测定结果与戴建荣等（2002年）敏感性测定结果进行比较，所有采样点钉螺之间以及重合采样点间钉螺对WPN的敏感性也均无统计学差异。研究结果表明，不同地区或不同类型流行区钉螺对氯硝柳胺的敏感性未见差异，与2002年调查结果比较，大陆钉螺对氯硝柳胺的敏感性也未发现降低趋势。提示我们氯硝柳胺在不同现场杀螺效果不一致，并不是因为不同地区钉螺对氯硝柳胺的敏感性存在差异，或钉螺对氯硝柳胺产生了抗药性，而可能是不同现场的环境、气候等因素的差异所致，所以今后的灭螺工作中需因地制宜，考虑灭螺现场的环境、气候因素，从而对施药量进行适量校正，以达到最优的杀螺效果；其次，不同实验室进行杀螺药药效评价以及新药筛选时，采集于不同现场的钉螺本身对杀螺药的敏感性差异不会对实验结果产生影响，不同实验室间杀螺药药效评价以及新药筛选结果具有可比性；虽然未发现中国大陆钉螺对氯硝柳胺的敏感性发生实质性变化，但继续建立和完善中国大陆钉螺对氯硝柳胺敏感性数据库仍十分必要。综上所述，钉螺对氯硝柳胺的敏感性受温度以及钉螺与药物可接触时间的影响；但研究未发现不同季节或不同地区的钉螺对氯硝柳胺的敏感性存在差异；通过与2002年测定结果比较，自2002年至今，大陆钉螺对氯硝柳胺的敏感性未发现明显的上升或下降趋势，即未发现大陆钉螺对氯硝柳胺表现出抗药性。所以在今后的现场灭螺工作、实验室杀螺药筛选与药效评价，以及钉螺对杀螺药的抗药性监测工作中，除考虑药物浓度因素外，还有必要考虑环境温度、钉螺与药物可接触时间等因素的影响。而在温度、湿度和光照等条件一致的标准化浸杀条件下，全年采集于不同季节或不同地区的钉螺用于药效评价与新药筛选是可行的，结果不会受到钉螺自身敏感性的影响，不同实验室间相关的实验结果具有一定的可比性；采集于不同季节或不同地区的钉螺也不会影响钉螺对杀螺药抗药性监测结果的准确性。
【作者】李幼子；
【导师】戴建荣；
【作者基本信息】江苏省血吸虫病防治研究所，病原生物学，2012，硕士
【关键词】日本血吸虫病；钉螺；氯硝柳胺；敏感性；互补重对数模型；

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